2017年5月12日，清華大學(xué)生命學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心施一公研究組于《細(xì)胞》（Cell）在線發(fā)表了題為《人源剪接體的原子分辨率結(jié)構(gòu)》（An Atomic Structure of the Human Spliceosome）。這是第一個高分辨率的人源剪接體結(jié)構(gòu)，也是首次在近原子分辨率的尺度上觀察到酵母以外的、來自高等生物的剪接體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步揭示了剪接體的組裝和工作機(jī)理，為理解高等生物的RNA剪接過程提供了重要基礎(chǔ)。
在真核生物細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)基因是不連續(xù)的，它們的編碼區(qū)（exon）被稱為“內(nèi)含子（intron）”的非編碼序列隔斷。在基因表達(dá)過程中，內(nèi)含子需要經(jīng)過“剪”和“接”這兩步化學(xué)反應(yīng)被去除，從而使得編碼區(qū)可以連接成不同的信使RNA（mRNA）。同一個基因，因為內(nèi)含子的邊界和數(shù)量不同，經(jīng)過剪接，便可以產(chǎn)生出多種編碼蛋白的mRNA。RNA剪接是所有真核生物特有的過程，是真核生物“中心法則”的關(guān)鍵步驟之一，也被認(rèn)為是真核生物復(fù)雜性的重要分子基礎(chǔ)。RNA剪接過程必須高度精準(zhǔn)，任何錯誤都有可能導(dǎo)致基因表達(dá)異常乃至疾病的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，1/3以上的遺傳性疾病與RNA剪接異常有關(guān)。
RNA剪接這一復(fù)雜的生理過程由剪接體（spliceosome）來執(zhí)行。剪接體是細(xì)胞中已知的最為復(fù)雜的大分子機(jī)器，分子量巨大并且高度動態(tài)，主要由蛋白質(zhì)-核酸形成的復(fù)合物（ribonucleoprotein，RNP）組裝形成，它在前體信使RNA（pre-mRNA）上完成識別、組裝、激活、催化等一系列過程，并最終在反應(yīng)結(jié)束后解離成許多小的功能單元，以進(jìn)入下一個反應(yīng)循環(huán)。根據(jù)剪接體的組成與構(gòu)象的不同，可以將剪接體分為E、A、B、Bact、B*、C、C*、P、ILS等若干狀態(tài)（圖1）。
圖1. 剪接反應(yīng)過程示意圖
（圖片修改自Janine，2012）
解析剪接體的高分辨率結(jié)構(gòu)對于理解剪接反應(yīng)的機(jī)理至關(guān)重要。2015年8月，施一公課題組在世界上率先解析了酵母剪接體的高分辨率結(jié)構(gòu)，在2016年又陸續(xù)報道了酵母剪接體在不同工作狀態(tài)下的高分辨結(jié)構(gòu)，提供了迄今為止最為全面和清晰的剪接體結(jié)構(gòu)信息，揭示了RNA剪接的分子基礎(chǔ)，極大地推動了這一領(lǐng)域的發(fā)展。
然而與酵母剪接體相比，以人類為代表的高等生物的剪接體組成、組裝和調(diào)控更為復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)研究也因為組成的復(fù)雜性和構(gòu)象的不穩(wěn)定性而進(jìn)展緩慢。由于超過1/3的人類遺傳病與剪接過程中的錯誤直接相關(guān)，解析人源剪接體的結(jié)構(gòu)不僅能幫助理解剪接反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)，更能促進(jìn)對一些疾病發(fā)病機(jī)制的理解，并為研發(fā)針對剪接體的相關(guān)藥物提供可能。因此人源剪接體的結(jié)構(gòu)解析是極其重要并亟需解決的難題。
在最新發(fā)表的《細(xì)胞》研究長文中，施一公研究組利用修飾過的pre-mRNA，在體外進(jìn)行人源剪接體的組裝，把剪接反應(yīng)鎖定在了第一步反應(yīng)之后與第二步反應(yīng)之前的狀態(tài)，即C*狀態(tài)。由于人源剪接體非常不穩(wěn)定，研究人員使用化學(xué)交聯(lián)劑在溫和的條件下對剪接體進(jìn)行固定，成功獲得了穩(wěn)定的人源剪接體樣品，并采用單顆粒冷凍電鏡重構(gòu)出了3.8埃的近原子分辨率結(jié)構(gòu)（圖2和圖3）。
圖2. 人源剪接體的結(jié)構(gòu)示意圖
圖3. 人源剪接體與酵母剪接體的比較
在該結(jié)構(gòu)中，剪接體核心區(qū)分辨率高達(dá)3.0-3.5埃，清晰地展示了由20余個蛋白與RNA組成的催化反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)（圖4 ）。同時，他們觀察到與第二步反應(yīng)密切相關(guān)的剪接因子所呈現(xiàn)出的特定構(gòu)象，對于穩(wěn)定反應(yīng)活性中心以及催化第二步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)至關(guān)重要。該結(jié)構(gòu)的解析為揭示第二步反應(yīng)過程中剪接體的構(gòu)象變化以及3 剪接位點的識別提供了重要的結(jié)構(gòu)依據(jù)。
圖4 人源剪接體的催化中心與調(diào)控機(jī)制
施一公教授為本文通訊作者； PTN項目15級博士生張曉峰、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者閆創(chuàng)業(yè)、醫(yī)學(xué)院博士生杭婧為本文共同第一作者，閆創(chuàng)業(yè)博士同時為本文共同通訊作者；生命學(xué)院博士后Lorenzo I. Finci 參與了這項研究；清華大學(xué)冷凍電鏡平臺主管雷建林研究員協(xié)助數(shù)據(jù)收集，平臺工作人員李曉梅、李曉敏在數(shù)據(jù)收集過程中提供了幫助；本課題得到了清華大學(xué)冷凍電鏡平臺，高性能計算平臺、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實驗技術(shù)中心（北京）的大力支持；本工作主要獲得北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的經(jīng)費支持，并獲得了國家自然科學(xué)基金委以及科技部的資助。
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